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DCypherTM: 以高靈敏度和特異性詢問染色質(zhì)讀數(shù)器鑒定和評估讀數(shù)器與核小體結(jié)合的測定 epicypher產(chǎn)品測定 epicypher產(chǎn)品測定

概述: 詢問染色質(zhì)閱讀器表觀遺傳閱讀器蛋白因其在細胞功能中的重要作用以及靶向藥物開發(fā)治療癌癥等疾病的潛力而受到廣泛關(guān)注。經(jīng)典的方法依賴于組蛋白肽拉降序列來詢問染色質(zhì)閱讀器的結(jié)合偏好1。然而，這些方法由于低靈敏度和/或高背景而受到高失敗率的困擾。這對于解決低親和力相互作用特別有問題，因為閱讀器蛋白在微摩爾范圍內(nèi)具有解離常數(shù)(Kd)是常見的。此外，線性肽不能概括在三維核小體結(jié)構(gòu)的背景下發(fā)生的體內(nèi)相互作用。為了解決這些問題，EpiCypher 已經(jīng)開發(fā)了一個敏感和強大的發(fā)現(xiàn)平臺，以利用含有不同翻譯后修飾(PTM)的多種重組核小體來詢問染色質(zhì)閱讀器的結(jié)合，組蛋白變體，突變和/或 DNA 甲基化狀態(tài)。DCypher 染色質(zhì)讀取器測定: 測量生理學(xué)染色質(zhì)相互作用的同質(zhì)生化測定。該測定利用 Perkin Elmer 的 AlphaScreenTM 技術(shù)，能夠定量評估讀取器結(jié)構(gòu)域與核小體的相互作用(圖1A)。同質(zhì)的“混合和測量"性質(zhì)，沒有洗滌步驟，高靈敏度和穩(wěn)健的方法使其成為詢問低親和力染色質(zhì)讀者-核小體相互作用的理想選擇。HP1 something 是一個已建立的 H3K9甲基讀取子2，與單甲基、二甲基和三甲基結(jié)合(圖1B)。然而，當(dāng)呈現(xiàn) EpiCypher 設(shè)計者核小體(dNucs)時，HP1 something 僅對 H3K9me3顯示顯著增強的特異性(圖1C)。這些發(fā)現(xiàn)強調(diào)了在生物相關(guān)的核小體背景下研究表觀遺傳閱讀器相互作用的重要性。這里描述的協(xié)議允許終端用戶優(yōu)化 dCypher 染色質(zhì)閱讀器分析，首先使用 GSTtagedBRD4Bromodomain 1(BD-1)作為一個健壯的控制。然后，該方案可以容易地適應(yīng)各種感興趣的表觀遺傳閱讀器結(jié)構(gòu)域，不同的蛋白質(zhì)標(biāo)簽(例如 GST，His 或 FLAG) ，并且與 EpiCypher 不斷擴大的物素化核小體組合兼容。此外，這種方法可以用來計算 Kd 表面積，以更準(zhǔn)確地比較相似的閱讀器和核小體結(jié)合對。圖1: 分析原理。用 dCypher 方法詢問染色質(zhì)閱讀器。(A)將物素化的核小體固定在鏈霉親和素供體珠上，并且通過抗標(biāo)簽綴合的 α 受體珠識別表位標(biāo)記的染色質(zhì)讀取器。供體的激光激發(fā)產(chǎn)生單線態(tài)氧，擴散激活受體的發(fā)射。熒光計數(shù)與核小體-讀取器相互作用橋接的供體-受體數(shù)量成正比。(B) HP1 something (0.15 nM)與物素化組蛋白肽的結(jié)合。(C) HP1 something (1nM)與物素化核小體的結(jié)合。

DCypher: 以高靈敏度和特異性詢問染色質(zhì)讀數(shù)器鑒定和評估讀數(shù)器與核小體結(jié)合的測定

測定緩沖液120mM Hepes pH7.5,250mM NaCl，0.01% BSAadd 0.01% NP-40和1mM DTT 新鮮度測定緩沖液220mM Hepes pH7.5,250mM NaCl，0.01% BSA,添加0.01% NP-40新鮮標(biāo)準(zhǔn)協(xié)議注意: 在加入每種試劑后簡要地離心平板(≤800xg? 10秒)以最大限度地提高重現(xiàn)性 * 不要旋轉(zhuǎn)或超聲處理核小體溶液 * * 為了確定感興趣的讀取蛋白的最佳濃度，首先用已知的陽性和陰性對照進行滴定(例如圖2) * * * AlphaScreen 供體珠對光敏感，應(yīng)該在柔和的照明下處理。* * * * 當(dāng)使用鎳螯合受體珠時，建議使用10μg/mL SA 供體珠和2.5 μg/mL 受體珠。加入5μL 在測定緩沖液12中制備的4X 核小體 * (10nM 最終)。加入5μL 在測定緩沖液1 * * 3中制備的4X 染色質(zhì)讀數(shù)器。在 RT4孵化30分鐘。在 DARK * * * 準(zhǔn)備的測定緩沖液2 * * * * 5中加入10μL 2X 鏈霉親和素供體珠(5μg/mL)和谷胱甘受體珠(2.5 μg/mL)。在 RT6孵化60分鐘。閱讀使用阿爾法板讀取器: Ex680nm，Em 520-620nm

圖2: 蛋白質(zhì)滴定法。在測試核小體文庫之前，讀取器結(jié)構(gòu)域的最佳篩選濃度可以通過用已知靶核小體和陰性對照進行滴定來確定。對于 BRD4 BD-1，評估結(jié)合未修飾(rNuc，EpiCypher # 16-0006)和四乙酰化(H4K5,8,12,16 ac，EpiCypher # 16-0313)核小體。理想的濃度范圍是30-200nM，提供足夠的信號超過背景和下面的鉤點(點信號開始下降后飽和的檢測試劑)。問: 如果我感興趣的讀者領(lǐng)域沒有已知的目標(biāo)，或者如果我發(fā)現(xiàn)與組蛋白肽發(fā)現(xiàn)的已知的結(jié)合相互作用沒有在核小體上重現(xiàn)，我該怎么辦? 答: EpiCypher 科學(xué)家對不同類別的讀者領(lǐng)域和實驗優(yōu)化有廣泛的經(jīng)驗。請與我們聯(lián)系，建立一個科學(xué)！

圖3: BRD4 BD-1與 DCYPHER 核小體 K-ACYLSTAT 面板的結(jié)合。 EpiCypher 具有不斷擴展的核小體文庫，具有單獨和組合修飾。使用100nM 蛋白質(zhì)評估 BRD4 BD-1與 dCypher K-AcylStat 面板的結(jié)合(參見圖2)。BRD4 BD-1對 H4K5,8,12,16 ac 具有特異性，對 H4上的個別乙酰修飾或 H3上的?；揎椌哂凶钚〉慕Y(jié)合。

用于染色質(zhì)重塑研究的全重組核小體底物

概述染色質(zhì)重塑，或核小體的重新定位，調(diào)節(jié) DNA 通路，從而基因表達和基因組修復(fù)。許多 ATP 依賴性重塑酶復(fù)合物與人類疾病有關(guān)，但由于對基于核小體的底物的需求，是具有挑戰(zhàn)性的研究目標(biāo)。EpiCypher 通過開發(fā)全重組重塑底物 EpiDyne 平臺來監(jiān)測核小體沿 DNA 的重新定位，從而滿足了這一需求。在這里，我們證明了 EpiDyne-FRET 在使用熒光共振能量轉(zhuǎn)移(FRET)讀數(shù)的均勻重構(gòu)分析中的應(yīng)用。

染色質(zhì)重塑作為治療目標(biāo)異常的核小體組織能夠嚴(yán)重破壞基因表達、 DNA 修復(fù)和細胞分化，并且在人類疾病中發(fā)揮重要作用，包括癌癥、炎癥、自身免疫、精神分裂癥、心血管疾病和智力障礙。值得注意的是，近20% 的癌癥都包含來自 SWI/SNF 家族的 ATP 依賴性染色質(zhì)重塑復(fù)合物的亞基突變。這些酶復(fù)合物通過“泵"組蛋白八聚體周圍的 DNA 來調(diào)節(jié)局部基因組的訪問，從而“滑動"核小體[1]。在多種癌癥中觀察到 SWI/SNF 亞基的復(fù)發(fā)性體細胞突變，支持腫瘤發(fā)生的驅(qū)動作用[2]。突變重塑蛋白是有吸引力的治療靶點，因為進一步降低其 ATP 酶活性促進癌細胞死亡，但節(jié)省正常細胞[2,3]。這種現(xiàn)象被稱為合成致死性，鑒定利用它的抑制劑可能導(dǎo)致具有癌癥特異性的藥物[4,5]。

染色質(zhì)重塑檢測使用重組單核小體底物埃皮塞弗已經(jīng)開發(fā)了表達式-熒光共聚染色質(zhì)重塑酶復(fù)合物來研究其功能。核小體由包裹在 ~ 147bp DNA 中的核心組蛋白八聚體組成，代表染色質(zhì)的基本重復(fù)單位。EpiDyne-FRET 由包裹在5’Cy3標(biāo)記的 DNA 中的末端定位的組蛋白八聚體(H2AT120C * Cy5)組成[8](圖1)。在其組裝的起始位置，Cy3-Cy5 FRET 最大，當(dāng)組蛋白八聚體重新定位(向模板 DNA 3’末端)或噴射時，通過 Cy5信號的丟失檢測到核小體重塑。圖1: EPIDYNE-FRET 核小體重塑底物由5’Cy3標(biāo)記的 DNA (217bp; 綠色球)包裹的 Cy5標(biāo)記的人組蛋白八聚體(H2A T120C-Cy5; 顯示為八聚體的紅色部分)組成，包括與核小體組裝難治性的 TGGA 重復(fù)區(qū)相鄰的末端核小體定位序列(147bp Widom 601[7])[8]。在組裝起始狀態(tài)下，Cy3-Cy5 FRET 達到最大值。當(dāng) Cy3標(biāo)記的 DNA 5’末端從 Cy5標(biāo)記的八聚體移開時，通過 FRET 信號的還原檢測 ATP 依賴性重塑劑(例如 RSC 或另一種 SWI/SNF ATP 酶)的活性。EpiDyne-FRET 是一種與 HTS 應(yīng)用立即兼容的一步免洗方法。

測定所需的試劑和材料[見注(i)]•酵母 RSC [9](底物也與 dACF [ ACF-ISWI ] ，dNoRC [ Toutatis-ISWI ]和人 SMARCA2/4(BRG1/BRM)相容; 數(shù)據(jù)未顯示)• EpiDyne-FRET 核小體重塑底物(EpiCypher 目錄號16-4201)•測定緩沖液(20mM Tris pH 7.5,50mM KCl，3mM MgCl 2和0.1 mg/mL BSA (Sigma 目錄號。A3059)• ATP (Invitrogen 目錄號。PV3227)•可選: ATPγS (一種非水解形式的 ATP)• Corning 3820384孔測定板(Fisher Catalog No. 07-200-891)•用于384孔板的16通道多頻儀•384孔熒光微板讀數(shù)器能夠進行 Cy3/Cy5-FRET 檢測(例如 Envision，Perkin Elmer)標(biāo)準(zhǔn)協(xié)議1。根據(jù)預(yù)期的時間點/重復(fù)(一式三份)確定所需的 RSC (10nM 最終) ，EpiDyne-FRET (20nM 最終)和 ATP (2mM 最終)的量[參見注釋(ii & iii)]。準(zhǔn)備反應(yīng)組分(室溫)。I. 2x 酶/底物溶液(20nM RSC + 40nMEpiDyne-FRET 底物在2x 測定緩沖液中)。2x ATP +/-抑制劑溶液(所需的 ddH2O + 抑制劑[例如 ATPγS ]中的4mM ATP)3。加入5μL 的2倍酶/底物溶液到微孔板上。4。通過加入5μL 的2xATP +/-抑制劑溶液來啟動反應(yīng)。5。在適當(dāng)?shù)臅r間點，在384孔板讀取器中讀取，能夠檢測到 Cy3(激發(fā) -531nm/發(fā)射 -579nm)/Cy5(發(fā)射 -685nm)。數(shù)據(jù)表示為原始 Cy3和 Cy5發(fā)射信號在每個時間點的比值[8]。

注意事項(i)把蛋白樣本貯存在攝氏零下80度，并避免冷凍/解凍。(ii)對于測定開發(fā)，建議對多種反應(yīng)組分(包括酶、底物和 ATP)的濃度進行滴定。(iii)由于數(shù)據(jù)表示為 Cy3-Cy5發(fā)射，因此重要的是不要在這些反應(yīng)中添加多余的底物。(iv)反應(yīng)可迅速開始。如果設(shè)置一個大板沒有一個自動注射器有沒有一個能力的 T0為每個條件。2018年，NC。所有權(quán)利保留  由染色質(zhì)重塑復(fù)合物 NURF 介導(dǎo)的 ATP 依賴性組蛋白八聚體滑移。1999年的牢房。97(7) : p. 833-42.2.SMARCA2/4 ATP 酶結(jié)構(gòu)域在 SWI/SNF 突變型癌癥中超越 Bromodomain 作為藥物靶點: 來自 cDNA 拯救和 PFI-3抑制劑研究的見解。巨蟹座，2015年。75(18) : p. 3865-78.3.針對染色質(zhì)重塑 BRG1增加了化藥物在乳腺癌細胞中的療效。腫瘤目標(biāo)，2016年。7(19) : p. 27158-75.4.Helming，K.C. ，X. Wang，and C.W. Roberts，突變 SWI/SNF 復(fù)合物在癌癥中的脆弱性。癌細胞，2014年。26(3) : p. 309-17.5.Karnezis，A.N. 等，SWI/SNF 復(fù)合物 ATP 酶 SMARCA4/BRG1和 SMARCA2/BRM 的雙重喪失對于卵巢高鈣血癥型小細胞癌是高度敏感和特異性的。JPathol 2016年。238(3) : p. 389-400.6.Clapier，C.R. ，等，染色質(zhì)重塑者 RSC/Sth1中 DNA 易位效率的調(diào)節(jié)增強核小體的滑動和射出。Mol Cell，2016年。62(3) : p. 453-61.7.Lowary 和 J.Widom，高親和力結(jié)合組蛋白八聚體的新 DNA 序列規(guī)則和序列定向核小體定位。J Mol Biol 1998年。276(1) : p. 19-42.8.等人，TGGA 重復(fù)損害核小體的形成。J Mol Biol 1998年。281(2) : p. 253-60.

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